광학 현미경

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1. 개요
2. 종류
3. 기본 구조 및 구성 요소
4. 작동 원리
- 4.1. 배율
- 4.2. 조명 기술
5. 역사
6. 응용 분야
7. 한계
- 7.1. 회절 한계
- 7.2. 회절 한계 극복 기술
8. 대안
9. 광학 현미경의 사용 방법
참조

1. 개요

광학 현미경은 렌즈를 사용하여 작은 물체를 확대하여 관찰하는 데 사용되는 도구이다. 크게 단순 현미경과 복합 현미경으로 나뉘며, 복합 현미경은 다양한 종류와 조명 기술을 통해 여러 분야에서 활용된다. 현미경은 기본적인 구조와 구성 요소를 가지며, 배율과 조명 기술을 통해 작동한다. 광학 현미경은 마이크로전자공학, 생명공학, 의료 진단 등 다양한 분야에서 사용되며, 특히 조직 검사나 미생물학 연구에 중요한 역할을 한다. 그러나 가시광선의 회절 한계로 인해 분해능에 한계가 있으며, 이를 극복하기 위해 형광 현미경, 공초점 현미경 등 다양한 기술이 개발되었다. 광학 현미경은 올바른 사용법을 숙지하여야 하며, 조리개 사용법, 초점 조절, 외부 광원 이용 등의 방법을 통해 정확한 관찰이 가능하다.

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광학 현미경

2. 종류

광학 현미경은 크게 단순 현미경과 복합 현미경 두 가지로 나뉜다. 단순 현미경은 하나의 렌즈나 렌즈 그룹을 사용하여 물체를 확대하는 반면, 복합 현미경은 여러 렌즈 시스템을 조합하여 훨씬 높은 배율로 물체를 관찰할 수 있게 한다. 현대 연구용 현미경은 대부분 복합 현미경이며, 일부 저렴한 상업용 디지털 현미경은 단순 현미경을 사용한다. 복합 현미경은 광학 구성, 비용, 용도에 따라 더 세분화될 수 있다.

2. 1. 단순 현미경 (Simple microscope)

단순 현미경은 렌즈 또는 렌즈 세트를 사용하여 각 배율만으로 물체를 확대하여 관찰자에게 똑바로 선 확대된 가상 이미지를 제공한다.^[1]^[2] 단일 볼록 렌즈 또는 렌즈 그룹은 돋보기, 루페, 망원경 및 현미경의 접안렌즈와 같은 단순 확대 장치에서 사용된다.

최초로 개발된 현미경으로, 단일 렌즈에 의한 관찰법의 확장으로 개발되었다. 한 그룹의 렌즈만으로 구성된 현미경을 '''단식 현미경'''(Simple optical microscope)이라고 부른다. 네덜란드의 안토니 판 레이벤훅은 자신이 직접 만든 현미경으로 다양한 생물학적 발견을 한 것으로 알려져 있다.

2. 2. 복합 현미경 (Compound microscope)

복합 현미경은 관찰 대상에 가까운 대물 렌즈를 사용하여 빛을 모으고, 현미경 내부에서 물체의 실상을 맺는다(이미지 1). 이 이미지는 접안 렌즈라고 불리는 두 번째 렌즈 또는 렌즈 그룹에 의해 확대되어 관찰자에게 확대된 거꾸로 된 허상을 제공한다.^[3] 복합 대물 렌즈/접안 렌즈 조합을 사용하면 훨씬 더 높은 배율을 얻을 수 있다. 일반적인 복합 현미경은 교체 가능한 대물 렌즈를 가지고 있어 사용자가 배율을 쉽게 조절할 수 있다.^[3] 또한, 위상차 현미경과 같이 더 발전된 조명 설정을 사용할 수 있게 한다.

광학 현미경은 보통 시료에 빛을 비춰 투과광이나 반사광, 또는 형광 등 시료가 발하는 빛을 렌즈로 결상시켜 관찰한다. 관찰 가능한 배율은 일반적으로 수십 배에서 수백 배, 최고 2천 배 정도이다.

현미경 기술을 '''현미경법'''(microscopy), '''검경법'''이라고도 한다. 시료를 현미경으로 관찰할 수 있는 상태로 만든 것을 프레파라트라고 부르며, 보통은 슬라이드 글라스에 붙인 시료를 적당한 굴절률의 봉입제와 함께 커버 글라스 아래에 봉한 것을 사용한다.

최초로 개발된 현미경은 단일 렌즈에 의한 관찰법을 확장한 것이다. 한 그룹의 렌즈만으로 구성된 현미경을 '''단식 현미경'''(Simple optical microscope)이라 부르고, 두 그룹 이상의 렌즈로 구성된 현미경을 '''복식 현미경'''(Compound optical microscope)이라고 부른다. 단식 현미경의 경우, 네덜란드의 안토니 판 레이벤훅이 자작 현미경으로 다양한 생물학적 발견을 한 것으로 알려져 있다.

2. 2. 1. 목적에 따른 분류

광학 현미경은 사용 목적에 따라 다양하게 분류된다. 주요 유형은 다음과 같다:

실체 현미경: 낮은 배율로 표본의 입체적인 모습을 관찰하며, 주로 해부 등에 사용된다.
비교 현미경: 두 개의 광학 경로를 통해 두 표본을 동시에 비교한다.
도립 현미경: 표본을 아래쪽에서 관찰하며, 액체 속 세포 배양이나 금속학 연구에 유용하다.
광섬유 커넥터 검사 현미경: 커넥터 단면 검사에 특화되어 있다.
이동 현미경: 높은 광학 해상도를 가진 표본 연구에 사용된다.
금속 현미경: 금속 표면 관찰에 적합하며, 대물렌즈 쪽에서 빛을 비춰 반사광으로 관찰하는 낙사 조명 방식을 사용한다.
생물 현미경: 주로 의학 및 생물학 분야에서 사용되며, 투과 관찰 방식(명시야 현미경)을 사용한다.
명시야 현미경: 가장 기본적인 광학 현미경으로, 시료를 균일한 빛으로 비춰 빛 흡수율 차이에 따른 대비를 이용한다. 흡수율이 낮은 시료는 염색이 필요할 수 있다.
암시야 현미경: 시료에 비스듬히 빛을 비춰 산란광이나 반사광을 관찰한다. 배경이 검고 시료가 빛나게 보이며, 작은 물체 존재를 높은 대비로 관찰할 수 있다.
쌍안 실체 현미경: 두 세트의 광학계로 큰 시료를 입체적으로 관찰하며, 낮은 배율(수 배 ~ 수십 배)을 가진다. 제품 검사 등에 사용된다.
측정 현미경: 시료 계측용 현미경으로, 스테이지에 측정기나 눈금이 있고, 시야에 마이크로미터나 템플릿이 표시된다. 텔레센트릭 광학계를 채용하는 경우가 많다.
해부 현미경: 낮은 배율(수 배)의 렌즈를 스테이지에 고정한 형태이다.
편광 현미경: 물체의 편광성을 관찰한다. 편광자와 분석기를 사용하여 시료의 편광성이나 복굴절성을 명암이나 색 차이로 관찰한다. 암석 결정이나 생체 시료 내 결정질 물질 관찰에 사용된다.
LC-Polscope: 편광 현미경의 단점을 보완한 시스템으로, 전자 제어 편광판과 이미지 분석 장치를 조합하여 결정 구조의 편광 방향과 세기를 한 번에 관찰한다. 인공 수정된 가축 수정란 선별 등에 사용된다.

조명 기술에 따른 분류는 다음과 같다:

편광 현미경: 편광 필터, 회전 스테이지, 석고판을 포함하여 방향에 따라 광학적 특성이 달라지는 광물, 결정성 물질 연구에 용이하다.
위상차 현미경: 위상차 조명 방법을 적용한다.
형광 현미경: 형광단을 포함하는 표본 분석을 위해 설계되었다.
공초점 현미경: 형광을 위해 표본을 조명하기 위해 스캐닝 레이저를 사용하는 에피형광 조명의 변형이다.
2광자 여기 현미경: 생체 표본에서 산란 매체 내부 형광을 더 깊이 영상화하고 광퇴색을 줄이는 데 사용된다.
초현미경: 광 산란을 이용하여 직경이 가시광선 파장(약 500나노미터) 이하 또는 근처인 미세 입자를 관찰한다. 전자 현미경 출현 이후 대부분 사용되지 않는다.
팁 증강 라만 현미경: 팁 증강 라만 분광법을 기반으로 하는 광학 현미경의 변형으로, 전통적인 파장 기반 해상도 제한이 없다.^[5]^[6] 주사 탐침 현미경 플랫폼에서 구현된다.

기타:

학생용 현미경: 학교 사용 또는 어린이를 위한 초급 기기로, 간소화된 제어 장치와 저품질 광학 장치를 갖춘 저배율 현미경이다.^[4]

2. 2. 2. 조명 기술에 따른 분류

광학 현미경은 다양한 조명 기술을 사용하여 표본을 관찰하고 분석한다. 주요 조명 기술에 따른 광학 현미경의 분류는 다음과 같다.

명시야 현미경: 가장 기본적인 광학 현미경으로, 시료를 균일한 빛으로 비추어 시료 각 부분의 빛 흡수율 차이에 따른 대비를 이용하여 관찰한다. 흡수율이 낮은 시료는 염색이 필요할 수 있다.^[4]

암시야 현미경: 시료에 비스듬히 빛을 비추어 산란광이나 반사광을 관찰한다. 시야 배경은 검고, 시료는 빛나 보인다. 가시광선 파장보다 작은 물체의 존재를 높은 대비로 관찰할 수 있다.

위상차 현미경: 무색 투명하지만 굴절률이 다른 부분으로 구성된 시료를 관찰하기 위한 현미경이다. 굴절률 차이에 의해 발생하는 빛의 위상 변화를 이용한다. 체르니케가 고안하였으며, 1953년 노벨 물리학상을 수상했다.

편광 현미경: 물체의 편광성을 관찰하는 방법이다. 광학 현미경의 콘덴서 자리에 편광자(편광판)를 놓고, 대물 렌즈 뒤에 지연판과 분석기(편광판)를 놓아 시료의 편광성이나 복굴절성을 명암이나 색 차이로 관찰한다. 암석 등의 결정이나 생물 시료에 포함된 결정질 물질 관찰에 사용된다.

형광 현미경: 시료에서 방출되는 형광을 관찰하는 현미경이다. 시료 고유의 자발 형광을 관찰하거나, 형광 염료로 염색하거나, 형광성 단백질을 발현시켜 관찰한다. 특정 파장의 빛(여기광)을 시료에 조사하고, 시료가 방출하는 형광을 필터로 추출한다.

전반사 조명 형광 현미경: 형광 현미경 조명에 전반사를 이용하는 방법이다. 유리 표면 근방의 시료만 선택적으로 형광 관찰을 할 수 있다. 1990년대 일본에서 크게 발전했다.

공초점 현미경: 형광을 위해 표본을 조명하기 위해 스캐닝 레이저를 사용하는, 널리 사용되는 에피형광 조명의 변형이다.

2광자 여기 현미경: 특히 생체 표본에서 산란 매체 내부 형광을 더 깊이 영상화하고 광퇴색을 줄이는 데 사용된다.

초현미경: 광 산란을 사용하여 직경이 가시광선 파장(약 500나노미터) 이하 또는 그 근처인 미세 입자를 볼 수 있도록 개조된 광학 현미경이다. 전자 현미경 출현 이후 대부분 사용되지 않는다.

팁 증강 라만 현미경: 전통적인 파장 기반 해상도 제한이 없는 팁 증강 라만 분광법을 기반으로 하는 광학 현미경의 변형이다.^[5]^[6]

라만 현미경: 레이저 광선을 시료에 조사했을 때 발생하는 라만 산란광을 검출하여 이미지를 얻는다.

비선형 광학 현미경: 고조파 발생, 광 혼합 등의 비선형 광학 현상을 이용한 현미경이다.

2. 3. 디지털 현미경 (Digital microscope)

디지털 현미경은 디지털 카메라가 장착된 현미경으로, 컴퓨터를 통해 샘플을 관찰할 수 있다. 현미경은 다양한 수준의 자동화로 부분적으로 또는 전체적으로 컴퓨터 제어가 가능하다. 디지털 현미경을 사용하면 현미경 이미지에 대한 더 큰 분석이 가능하며, 예를 들어 거리와 면적을 측정하고 형광 또는 조직학적 염색을 정량화할 수 있다.^[7]

저배율 디지털 현미경인 USB 현미경도 상업적으로 판매되고 있다. 이들은 본질적으로 고배율 매크로 렌즈가 장착된 웹캠이며 일반적으로 투과 조명을 사용하지 않는다. 카메라는 컴퓨터의 USB 포트에 직접 연결되어 모니터에 이미지를 직접 표시한다. 이들은 접안렌즈를 사용할 필요 없이 매우 저렴한 비용으로 적당한 배율(최대 약 200×)을 제공한다. 고출력 조명은 일반적으로 카메라 렌즈 옆에 있는 LED 광원에 의해 제공된다.

매우 낮은 수준의 빛을 사용하는 디지털 현미경은 취약한 생물학적 샘플의 손상을 피하기 위해 민감한 광자 계수 디지털 카메라를 사용하여 사용할 수 있다. 광자 얽힘의 쌍을 제공하는 광원은 가장 빛에 민감한 샘플에 대한 손상 위험을 최소화할 수 있음이 입증되었다. 고스트 이미징을 광자가 희소한 현미경에 적용하면, 샘플은 적외선 광선으로 조명되며, 각 광선은 광자 계수 카메라에 의한 효율적인 이미징을 위해 가시광선 대역의 얽힌 파트너와 공간적으로 상관 관계가 있다.^[7]

3. 기본 구조 및 구성 요소

투과광을 통해 시료를 관찰하도록 설계된 현대 광학 현미경은 빛이 지나가는 경로에 다음과 같은 기본 구성 요소를 가지고 있다. 또한, 대부분의 현미경은 동일한 '구조적' 구성 요소를 갖추고 있다.^[25] (오른쪽 이미지 번호 참조)

접안렌즈 (1)
대물 렌즈 터렛, 리볼버 또는 회전 노즈피스 (여러 대물 렌즈를 장착하기 위해) (2)
대물렌즈 (3)
초점 조절 손잡이 (스테이지 이동)
* 조동 나사 (4)
* 미동 나사 (5)
스테이지 (시료를 고정) (6)
광원 (빛 또는 거울) (7)
조리개 및 컨덴서 (8)
기계적 스테이지 (9)

; 접안렌즈

접안렌즈는 두 개 이상의 렌즈를 포함하는 원통형 부품으로, 눈으로 이미지를 볼 수 있도록 초점을 맞추는 기능을 한다. 접안렌즈는 경통의 상단에 삽입되며, 다양한 배율을 가진 여러 접안렌즈로 교체할 수 있다. 일반적인 접안렌즈의 배율은 5×, 10× (가장 일반적), 15× 및 20×이다.

; 대물 렌즈 회전판

대물 렌즈 회전판(회전기 또는 회전 노즈 피스)은 여러 대물렌즈 세트를 장착하는 부분이다. 이를 통해 사용자는 대물렌즈를 전환할 수 있다.

; 대물렌즈

일반적인 복합 광학 현미경의 하단에는 시료에서 빛을 모으는 하나 이상의 대물렌즈가 있다. 대물렌즈는 일반적으로 유리, 단일 또는 다중 요소 복합 렌즈가 들어 있는 원통형 하우징에 있으며, 보통 회전하여 필요한 대물렌즈를 선택할 수 있는 원형 노즈피스에 약 3개의 대물렌즈가 나사로 조여져 있다. 이러한 배열은 공초점 렌즈로 설계되어, 현미경에서 한 렌즈에서 다른 렌즈로 변경할 때 시료가 초점을 유지한다. 현미경 대물렌즈는 배율과 개구수라는 두 가지 매개변수로 특징지어진다.

; 조정 손잡이

조정 손잡이는 대물대를 위아래로 움직이며, 조동 및 미동 초점 조절을 통해 현미경을 서로 다른 두께의 시료에 맞춰 조절할 수 있다. 구형 현미경 설계에서는 초점 조절 휠이 현미경 튜브를 스탠드에 상대적으로 위아래로 움직였으며, 대물대는 고정되어 있었다.

; 프레임

광학 조립체의 전체는 전통적으로 강성 팔에 부착되며, 이는 다시 견고한 U자형 발에 부착되어 필요한 강성을 제공한다. 팔의 각도는 시야각을 조절할 수 있도록 조정할 수 있다. 프레임은 다양한 현미경 제어 장치를 장착하는 지점을 제공한다. 일반적으로 여기에는 초점을 맞추기 위한 제어 장치가 포함되며, 조대 초점을 조절하기 위한 큰 널링 휠과 미세 초점을 제어하기 위한 작은 널링 휠이 함께 제공된다.

; 스테이지

스테이지는 관찰할 표본을 지지하는 대물렌즈 아래의 플랫폼이다. 스테이지 중앙에는 빛이 통과하여 표본을 비추는 구멍이 있다. 스테이지는 일반적으로 슬라이드를 고정하는 암을 가지고 있다. 100배 이상의 배율에서는 손으로 슬라이드를 움직이는 것은 실용적이지 않기 때문에, 중간 가격대 이상의 현미경에는 기계식 스테이지가 일반적이다. 기계식 스테이지는 원하는 대로 표본/슬라이드의 위치를 조정하는 제어 노브를 통해 슬라이드의 미세한 움직임을 가능하게 한다.

; 경대・경주(베이스・암)

현미경의 골격이며, 각 요소를 정확한 위치에 지지한다.

; 조명 장치

관찰을 위한 빛을 공급한다. 램프나 반사경, 컨덴서 등이 있다.

; 레볼버

대물렌즈를 여러 개 장착하여 회전시켜 사용할 대물렌즈를 전환할 수 있다.

; 경통

대물렌즈와 접안렌즈의 정확한 위치를 잡아 광로를 확보한다.

; 초점 조절 장치

프레파라트와 대물렌즈와의 거리를 변화시켜 초점을 맞춘다.

19세기 후반, 칼 자이스사의 에른스트 아베에 의해 현미경의 광학계 이론적 기초가 확립되었다. 당시 칼 자이스사에서 제작된 현미경 스타일은 하나의 표준이 되었고, 전 세계의 제조업체들이 이를 본뜬 현미경을 제작했을 뿐만 아니라, 그 기본적인 디자인은 21세기에 이르러서도 학습용 현미경 등에 계승되고 있다.

20세기 초 칼 자이스형 현미경에서는 대물렌즈와 접안렌즈가 경통의 상하에 일직선으로 배치되어 있었다. 관찰하기 쉽도록 광학계 전체를 기울일 수 있게 되어 있지만, 시료를 액체로 봉한 일시 프레파라트 등에서는 기울일 수 없는 경우도 있었다.

현재는 프리즘을 사용하여 광로를 굴곡시키고, 대물렌즈는 수직(프레파라트는 수평)을 유지하면서 접안렌즈는 비스듬하게 하여 관찰하기 쉽도록 한 것이 일반적이다. 관찰자의 부담을 더 줄이기 위해 대물렌즈에서 들어온 빛을 프리즘으로 분할하여 좌우의 접안렌즈로 분배하는 타입이 많다. 이러한 현미경은 쌍안 현미경이라고도 불린다.

초점 조절 장치는 과거에는 경주와 거기에 고정된 스테이지에 대해 경통을 상하로 움직이는 구조였지만, 굴곡 광학계의 채용에 따라, 경통 쪽을 경주와 일체화하여 스테이지 및 컨덴서를 상하로 움직이는 구조가 일반화되었다.

1990년대부터 '''무한 원점 보정 광학계'''가 보급되었다. 대물렌즈는 중간상을 맺지 않고 평행 광선을 방출하며, 경통 내의 결상 렌즈(튜브 렌즈)에서 중간상을 맺는다. 평행 광선이 되는 부분의 길이는 자유롭게 변경할 수 있으며, 하프 미러 등을 삽입해도 고스트나 수차가 발생하지 않는다. 유한계와 무한계의 대물렌즈는 그 기능이 완전히 다르기 때문에 호환성은 없다.

4. 작동 원리

광학 현미경은 시료에 빛을 비추어 렌즈를 통해 확대된 상을 얻는 장치이다. 빛은 시료를 투과하거나, 시료에서 반사되거나, 또는 시료가 형광을 발하는 방식으로 상호작용한다. 일반적으로 수십 배에서 수백 배, 최대 2,000배까지 확대하여 관찰할 수 있다.^[1]

현미경을 사용한 관찰 기술은 '''현미경법'''(microscopy) 또는 '''검경법'''이라고 불린다. 현미경 관찰을 위해 준비된 시료는 프레파라트라고 하며, 보통 슬라이드 글라스 위에 시료를 놓고 굴절률이 적절한 봉입제로 덮은 후 커버 글라스로 밀봉하여 만든다.

광학 현미경은 최초로 개발된 현미경 종류이다. 하나의 렌즈 그룹만 사용하는 '''단식 현미경'''(Simple optical microscope)과 두 개 이상의 렌즈 그룹을 사용하는 '''복식 현미경'''(Compound optical microscope)으로 나뉜다. 안토니 판 레이벤훅은 단식 현미경을 직접 제작하여 다양한 생물학적 발견을 했다. 일반적으로 사용되는 현미경은 복식 현미경이다.

복식 현미경의 주요 구성 요소는 다음과 같다.

구성 요소	기능
경대・경주 (베이스・암)	현미경의 골격, 각 요소를 지지
조명 장치	빛을 공급 (램프, 반사경, 컨덴서 등)
스테이지	프레파라트 고정
대물렌즈	프레파라트에 가까운 렌즈, 중간 실상을 맺음
레볼버	여러 개의 대물렌즈를 장착, 회전시켜 전환
경통	대물렌즈와 접안렌즈의 위치를 잡아 광로 확보
접안렌즈	대물렌즈가 맺은 중간 실상을 확대
초점 조절 장치	프레파라트와 대물렌즈 사이 거리 조절, 초점 조절

19세기 후반, 칼 자이스사의 에른스트 아베는 현미경 광학계의 이론적 기초를 확립했다. 칼 자이스사 현미경은 표준 모델이 되었고, 그 디자인은 21세기에도 학습용 현미경 등에 계승되고 있다.

초기 칼 자이스형 현미경은 대물렌즈와 접안렌즈가 경통 상하에 일직선으로 배치되었다. 관찰 편의를 위해 광학계 전체를 기울일 수 있었지만, 액체로 봉한 시료는 기울일 수 없었다.

현대 현미경은 프리즘을 사용하여 광로를 굴절시켜 대물렌즈는 수직, 접안렌즈는 비스듬하게 배치하여 관찰 편의성을 높였다. 또한, 프리즘으로 빛을 분할하여 좌우 접안렌즈로 보내는 '''쌍안 현미경'''이 일반적이며, 업무용으로는 단안 현미경보다 쌍안 현미경이 더 많이 사용된다. 촬영 장치용 경통을 가진 삼안식 현미경도 있다.

초점 조절 장치는 과거에는 경통을 상하로 움직이는 방식이었지만, 굴곡 광학계 채용 후에는 스테이지 및 컨덴서를 상하로 움직이는 방식이 일반화되었다.

1990년대부터는 '''무한 원점 보정 광학계'''가 보급되었다. 이 방식에서는 대물렌즈가 평행 광선을 방출하고, 경통 내 결상 렌즈(튜브 렌즈)에서 중간상을 맺는다. 평행 광선 부분의 길이를 자유롭게 변경할 수 있고, 하프 미러 등을 삽입해도 수차가 발생하지 않는다. 유한 원점 보정 광학계와 무한 원점 보정 광학계의 대물렌즈는 기능이 달라 호환되지 않는다.

최근에는 광학 현미경의 접안렌즈 부분에 CCD 이미지 센서와 액정 디스플레이를 설치하여 다수의 인원이 동시 관찰 및 디지털 촬영・녹화를 할 수 있게 한 제품이 "전자 현미경"으로 불리기도 하지만, 이는 원래의 전자 현미경과는 전혀 다른 것이다.

4. 1. 배율

복합 광학 현미경의 실제 배율은 대물렌즈와 접안렌즈의 배율을 곱한 값이다. 예를 들어 10x 접안렌즈와 100x 대물렌즈를 사용하면 총 1,000× 배율을 얻을 수 있다. 오일이나 자외선을 사용하면 해상도를 높여 1,000배 이상의 배율에서 세부 사항을 확인할 수 있다. 광학 현미경으로 관찰 가능한 배율은 일반적으로 수십 배에서 수백 배, 최고 2,000배 정도이다.^[1]

4. 2. 조명 기술

기본적인 현미경과 광학 기술은 400년 이상 사용되었지만, 오늘날과 같이 고품질 이미지를 만들기 위한 시료 조명 기술은 비교적 최근에 개발되었다.

1893년 8월, 아우구스트 쾰러는 쾰러 조명을 개발했다. 쾰러 조명 방식은 매우 균일한 조명을 제공하여 이전의 시료 조명 기술이 가진 여러 문제점을 해결했다. 쾰러 조명 이전에는 전구 필라멘트와 같은 광원의 이미지가 시료 이미지에 항상 나타났다.

프리츠 체르니케는 투명한 시료를 관찰할 수 있게 하는 위상차 현미경 조명 기술을 개발하여 1953년 노벨 물리학상을 수상했다. 빛의 간섭을 흡수 대신 사용함으로써, 살아있는 포유류 세포와 같이 매우 투명한 시료도 염색 없이 관찰할 수 있게 되었다. 1955년, 조르주 노마르스키는 또 다른 간섭 기반 이미징 기술인 미분 간섭 대비 현미경에 대한 이론을 발표했다.^[27]

현대 생물학적 현미경 기술은 세포 내 특정 구조를 위한 형광 교잡 탐침 개발에 크게 의존한다. 일반적인 투과 조명 현미경과 달리, 형광 현미경에서는 표본이 대물렌즈를 통해 좁은 파장 범위의 빛으로 조사된다. 이 빛은 표본 내의 형광단과 상호 작용하여 더 긴 파장의 빛을 방출한다. 이 방출된 빛이 이미지를 구성한다.

20세기 중반부터 DNA에 결합하는 DAPI와 같은 화학적 형광 염료가 세포 내 특정 구조를 표시하는 데 사용되었다. 최근에는 표본 내 특정 단백질을 인식하기 위해 형광 표지된 항체를 사용하는 면역 형광법과, 살아있는 세포가 형광성을 띄도록 유전자 발현을 통해 발현시킬 수 있는 GFP와 같은 형광 단백질이 개발되었다.

다양한 광원을 사용할 수 있다. 가장 간단한 방법은 거울을 통해 햇빛을 반사하는 것이다. 그러나 대부분의 현미경은 자체적으로 조절 가능하고 제어 가능한 광원을 갖추고 있는데, 흔히 할로겐 램프를 사용하지만 최근에는 LED와 레이저를 사용한 조명이 더 많이 사용된다. 더 비싼 장비에는 쾰러 조명이 제공되는 경우가 많다.

집광기는 광원에서 나오는 빛을 시료에 집중하도록 설계된 렌즈이다. 집광기는 조명의 품질과 강도를 관리하기 위해 조리개 및/또는 필터와 같은 다른 기능을 포함할 수도 있다. 암시야 현미경, 위상차 현미경, 미분 간섭 대비 현미경과 같은 조명 기법의 경우, 추가적인 광학 부품을 광 경로에 정확하게 정렬해야 한다.

시료로부터 향상된 대비 이미지를 생성하기 위해 광 경로를 수정하는 많은 기술들이 존재한다. 시료로부터 대비를 증가시키는 주요 기술에는 편광 현미경, 암시야, 위상차, 미분 간섭 대비 조명이 있다. 최근 기술(Sarfus)은 편광 현미경과 특정 대비 향상 슬라이드를 결합하여 나노미터 크기의 시료를 시각화한다.

5. 역사

최초의 현미경은 13세기에 안경에 렌즈가 널리 사용되면서부터 쓰인 것으로 보이며, 제한적인 배율을 가진 단일 렌즈 돋보기였다.^[8]

복합 현미경은 1620년경 유럽에서 처음 등장했는데,^[9]^[11] 여기에는 1621년경 런던에서 코르넬리우스 드레벨이 시연한 것과 1624년 로마에서 전시된 것이 포함된다.^[10]^[11]

복합 현미경의 실제 발명자는 알려져 있지 않지만, 여러 주장이 제기되었다. 네덜란드인 안경 제작자 요하네스 자하리아센은 그의 아버지 자카리아스 얀센이 1590년경 복합 현미경 및/또는 망원경을 발명했다고 주장했는데, 이는 복합 현미경이 등장한 지 35년 후였다.^[12] 요하네스의 증언은 일부에서 의심스럽다고 주장하며,^[13]^[14]^[15] 자카리아스가 그 당시 어린아이였을 것이라는 추측을 낳았다. 따라서 요하네스의 주장이 사실이라면 복합 현미경은 그의 할아버지인 한스 마르텐스가 발명했어야 할 것이다.^[14] 또 다른 주장으로는 얀센의 경쟁자인 한스 리퍼셰이(1608년에 최초의 망원경 특허를 신청)가 복합 현미경을 발명했다는 것이다.^[16] 다른 역사가들은 1621년에 복합 현미경을 발명한 네덜란드 혁신가 코르넬리우스 드레벨을 지목한다.^[10]^[11]

갈릴레오 갈릴레이도 복합 현미경 발명가로 언급되기도 한다. 1610년 이후 그는 자신의 망원경의 초점을 가까이하여 작은 물체를 확대하여 볼 수 있다는 것을 알게 되었고,^[17] 망원경 반대쪽 끝을 통해 작은 물체를 확대하여 볼 수도 있었다.^[18] 하지만 그의 2피트 길이 망원경을 6피트까지 늘려야 가까운 물체를 볼 수 있다는 단점이 있었다.^[19] 1624년 로마에서 드레벨이 제작한 복합 현미경을 본 후, 갈릴레오는 자신의 개선된 버전을 제작했다.^[10]^[11] 1625년, 조반니 파베르는 갈릴레오가 1624년 린체이 아카데미아에 제출한 복합 현미경에 "현미경"이라는 이름을 붙였다^[20] (갈릴레오는 "''occhiolino''", 즉 "작은 눈"이라고 불렀다). 파베르는 "작다"는 의미의 그리스어 ''μικρόν'' (micron)과 "보다"는 의미의 ''σκοπεῖν'' (skopein)을 따서 이름을 지었으며, 린체이들이 만든 "망원경"과 유사한 의미를 갖도록 했다.^[21]

17세기 말, 네덜란드인 크리스티안 호이겐스는 무색으로 보정된 간단한 2렌즈 접안 렌즈 시스템을 개발하여 현미경 개발에 큰 진전을 이루었다. 호이겐스 접안렌즈는 오늘날까지 생산되지만, 작은 시야 크기 등 사소한 단점이 있다.

안토니 판 레이우엔훅(1632–1724)은 16세기에 이미 간단한 확대 렌즈가 생산되었음에도 불구하고 현미경을 생물학자들의 주목을 받게 한 인물로 여겨진다. 판 레이우엔훅의 현미경은 작지만 강력한 단일 렌즈를 가진 단순 현미경이었다. 사용하기 불편했지만, 판 레이우엔훅은 상세한 이미지를 볼 수 있었다. 다중 렌즈 구성의 어려움으로 인해 복합 현미경이 판 레이우엔훅의 단순 현미경과 동일한 품질의 이미지를 제공하기까지 약 150년의 광학적 발전이 필요했다. 1850년대에 존 레너드 리델은 툴레인 대학교 화학과 교수로, 콜레라에 대한 최초이자 가장 광범위한 미국의 현미경 조사를 수행하면서 최초의 실용적인 쌍안 현미경을 발명했다.^[23]^[24]

6. 응용 분야

광학 현미경은 마이크로전자공학, 나노물리학, 생명공학, 제약 연구, 광물학 및 미생물학 분야에서 광범위하게 사용된다.^[28]

광학 현미경을 사용하여 습식 마운트 기술을 통해 촬영한 의료 도말 검사에서 세포의 40배 배율 이미지로, 표본을 유리 슬라이드에 놓고 염 용액과 혼합한 모습

광학 현미경은 의료 진단에 사용되며, 조직을 다룰 때는 조직 병리학, 또는 유리 세포나 조직 조각에 대한 도말 검사에 사용된다.

산업용으로 쌍안 현미경이 일반적이다. 진정한 깊이 인식이 필요한 응용 분야 외에도, 이중 접안 렌즈를 사용하면 현미경 작업대에서 장시간 작업 시 발생하는 눈 피로를 줄일 수 있다. 특정 응용 분야에서는 장초점 거리 또는 장초점 현미경^[29]이 유용하다. 물체를 창 뒤에서 검사해야 하거나, 산업용 피사체가 대물렌즈에 위험할 수 있다. 이러한 광학 장치는 근거리 초점 기능을 갖춘 망원경과 유사하다.^[30]^[31]

측정 현미경은 정밀 측정을 위해 사용된다. 기본적으로 두 가지 유형이 있다. 하나는 초점면에 거리를 측정할 수 있도록 레티클이 눈금으로 표시되어 있다.^[32] 다른 하나(더 오래된 유형)는 간단한 십자선과 현미경에 대한 피사체를 이동시키는 마이크로미터 메커니즘을 가지고 있다.^[33]

매우 작고 휴대 가능한 현미경은 실험실 현미경이 부담이 되는 곳에서 일부 사용되고 있다.^[34]

7. 한계

광학 현미경은 관찰 대상 물체가 빛에 미치는 다양한 효과를 이용한다. 가시광선을 사용하면 간편한 광원을 쓸 수 있고, 관찰자가 직접 색상 정보를 얻을 수 있다는 장점이 있다.

하지만 광학 현미경의 성능은 빛의 물리적 성질에 의해 제한을 받는다. 광학 현미경의 분해능은 가시광선의 파장에 크게 영향을 받는다. 이러한 한계를 극복하기 위해 더 짧은 파장의 X선을 이용하는 X선 현미경, 전자선을 사용하는 전자 현미경이 개발되었다. 또한, 터널 효과를 이용한 주사 터널 현미경이나 원자간력을 이용한 원자 현미경 등 표면 물리학을 응용한 현미경도 실용화되었다.

7. 1. 회절 한계

투과광을 사용한 매우 높은 배율에서 점 객체는 회절 고리로 둘러싸인 흐릿한 원반으로 보이는데, 이를 에어리 원반이라고 한다. 현미경의 분해능은 두 개의 가깝게 위치한 에어리 원반을 구별하는 능력(즉, 인접한 구조적 세부 사항을 뚜렷하고 분리되게 드러내는 현미경의 능력)이다. 미세한 세부 사항을 분해하는 능력을 제한하는 것은 바로 이러한 회절의 영향이다. 회절 패턴의 범위와 크기는 빛의 파장 (λ), 대물렌즈를 제조하는 데 사용되는 굴절 물질 및 대물렌즈의 개구수 (NA)에 의해 영향을 받는다. 따라서 대물 시야에서 별도의 점을 분해하는 것이 불가능한 유한한 한계가 있으며, 이를 회절 한계라고 한다. 전체 광학 장치에서 광학 수차가 무시할 수 있다고 가정하면, 분해능 ''d''는 다음과 같이 나타낼 수 있다.

:

d = \frac { \lambda } { 2 NA }

일반적으로 녹색광에 해당하는 550nm의 파장이 가정된다. 외부 매질로 대기를 사용하면, 가장 높은 실제 ''NA''는 0.95이고, 오일을 사용하면 최대 1.5이다. 실제로 기존 렌즈로 얻을 수 있는 ''d''의 최저 값은 약 200nm이다. 빛의 다중 산란을 이용한 새로운 유형의 렌즈를 통해 분해능을 100nm 미만으로 향상시킬 수 있었다.^[35]

7. 2. 회절 한계 극복 기술

1979년 Courjon과 Bulabois가 설명한 홀로그래피 기술은 투과광 한계를 넘어서는 해상도를 제공할 수 있지만, 실험적 분석에서 해상도가 제한되었다.^[36] 형광 시료를 사용하면 더 많은 기술을 활용할 수 있는데, Vertico SMI, 근접장 주사 광학 현미경(소멸파 사용), 자극 방출 소모 현미경 등이 그 예시이다. 2005년에는 단일 분자를 감지할 수 있는 현미경이 교육 도구로 설명되기도 했다.^[37]

지난 10년 동안 상당한 발전이 있었지만, 회절 한계를 극복하는 기술은 여전히 제한적이고 전문적이다. 대부분의 기술이 가로 해상도 증가에 초점을 맞추는 반면, 극도로 얇은 시료 분석을 가능하게 하는 기술도 존재한다. 예를 들어 사르푸스 방법은 얇은 시료를 대비를 향상시키는 표면에 놓아 0.3 나노미터 두께의 필름을 직접 시각화할 수 있게 한다.

2014년 10월 8일, 에릭 베치그, 윌리엄 머너, 슈테판 헬은 초고해상도 형광 현미경 개발에 기여한 공로로 노벨 화학상을 수상했다.^[38]^[39]

SMI(공간 변조 조명 현미경)는 점 확산 함수(PSF) 엔지니어링의 광학적 과정이다. 이는 광학적 해상도를 높이거나, 조명광의 파장에 비해 작은 형광 물체의 거리 측정을 최대화하거나, 나노미터 범위의 다른 구조적 매개변수를 추출하기 위해 현미경의 PSF를 적절한 방식으로 수정하는 과정이다.^[40]^[41]

3D Dual Color Super Resolution Microscopy Cremer from 2010 — 유방 세포 내 Her2와 Her3를 이용한 3D 듀얼 컬러 초고해상도 현미경, 표준 염료: Alexa 488, Alexa 568 LIMON

SPDM(분광 정밀 거리 현미경)은 형광 현미경의 광학적 과정으로, 광학 현미경의 이론적인 분해능 한계보다 훨씬 작은 "광학적으로 격리된" 입자(예: 분자)의 위치, 거리 및 각도를 측정할 수 있게 해주는 기본적인 위치 기반 현미경 기술이다. "광학적으로 격리된"이란 특정 시점에서 일반적인 광학 해상도(일반적으로 약 200~250nm 직경)로 결정되는 크기의 영역 내에서 단일 입자/분자만 감지된다는 것을 의미한다. 이는 이러한 영역 내의 분자가 모두 서로 다른 분광 마커(예: 다른 색상 또는 다른 입자의 빛 방출에서 사용 가능한 다른 차이)를 가지고 있을 때 가능하다.^[42]^[43]^[44]^[45]

GFP, Alexa 염료, Atto 염료, Cy2/Cy3 및 플루오레세인 분자와 같은 많은 표준 형광 염료는 특정 광물리적 조건이 존재할 경우 위치 기반 현미경에 사용할 수 있다. SPDMphymod(물리적으로 변형 가능한 형광체) 기술을 사용하면 적절한 강도의 단일 레이저 파장만으로 나노 이미징이 가능하다.^[46] 표준 형광 염료를 사용한 3D 초고해상도 현미경은 SPDMphymod에 대한 국소화 현미경과 SMI의 조합을 통해 달성할 수 있다.^[47]

자극 방출 소멸은 회절 한계를 넘어선 더 높은 해상도를 가능하게 하는 간단한 예시이지만, 주요한 제한 사항이 있다. STED는 샘플 내 형광 분자의 작은 하위 집단에서 형광을 유도하기 위해 일련의 빛 펄스를 사용하는 형광 현미경 기술이다. 각 분자는 이미지에서 회절 제한된 점의 빛을 생성하며, 이러한 각 점의 중심은 분자의 위치에 해당한다. 형광 분자의 수가 적기 때문에 빛의 점들이 겹칠 가능성이 낮아 정확하게 배치할 수 있다. 이 과정은 이미지를 생성하기 위해 여러 번 반복된다. 슈테판 헬은 STED 현미경 및 관련 방법론 개발에 대한 공로로 2006년 제10회 독일 미래상과 2014년 노벨 화학상을 수상했다.^[48]

8. 대안

가시광선의 회절 한계로 인한 제약을 극복하기 위해 다른 파동을 사용하는 현미경들이 설계되었다.

원자력 현미경(AFM)
주사 전자 현미경(SEM)
주사 이온 전도 현미경(SICM)
주사 터널링 현미경(STM)
투과 전자 현미경(TEM)
자외선 현미경
X선 현미경

높은 주파수의 파동은 물질과의 상호 작용이 제한된다는 점에 유의해야 한다. 예를 들어, 연조직은 X선에 비교적 투명하여 뚜렷한 대비의 원인이 되며, 다른 대상 응용 분야를 만들어 낸다.

빛 대신 전자와 X선을 사용하면 훨씬 더 높은 해상도를 얻을 수 있다. 방사선의 파장이 짧아 회절 한계가 낮아지기 때문이다. 단파장 탐침을 비파괴적으로 만들기 위해 원자 빔 이미징 시스템(원자 나노스코프)이 제안되어 문헌에서 광범위하게 논의되었지만, 아직 기존의 이미징 시스템과 경쟁할 수 없다.

STM과 AFM은 작은 프로브를 사용하여 표면을 스캔하는 주사 탐침 기술이다. 이러한 경우의 해상도는 프로브의 크기에 의해 제한된다. 마이크로 머시닝 기술은 팁 반경이 5nm–10nm인 프로브를 생성할 수 있다.

또한 전자 또는 X선 현미경과 같은 방법은 진공 또는 부분 진공을 사용하므로, 환경 주사 전자 현미경을 제외하고는 생체 시료에 대한 사용이 제한된다. 이러한 모든 기기에 필요한 시료실도 시료 크기를 제한하며, 시료 조작이 더 어렵다. 이러한 방법으로 만든 이미지에서는 색상을 볼 수 없으므로 일부 정보가 손실된다. 그러나 이것들은 알루미늄 합금의 시효 경화 또는 고분자의 미세 구조와 같은 분자 또는 원자 효과를 조사할 때 필수적이다.

9. 광학 현미경의 사용 방법

교육용 현미경을 기준으로 광학 현미경의 사용 방법을 설명한다.

1. 직사광선이 닿지 않는 밝은 곳에 현미경을 둔다.

2. 조동 핸들을 돌려 레볼버와 스테이지를 멀리한다.

3. 렌즈를 케이스에서 꺼낸다. 대물렌즈는 부착부를 위로 하여 수납되어 있으므로, 거꾸로 놓은 다음 케이스 본체를 빼서 부착부에 먼지가 들어가는 것을 막는다.

4. 접안렌즈, 대물렌즈를 경통 내로 먼지가 침입하지 않도록 이 순서로 장착한다. 레볼버를 회전시켜 저배율의 대물렌즈를 선택한다.

5. 접안렌즈를 들여다보면서 반사경을 움직여 밝기가 균일하게 되도록 한다. 절대로 직사광선을 사용해서는 안 된다.^[1]

6. 프레파라트를 스테이지 위에 놓고, 관찰 대상이 대물렌즈 바로 아래에 오도록 고정한다.

7. 현미경을 옆에서 보면서 조동 핸들을 움직여 대물렌즈와 프레파라트를 가깝게 한다.

8. 접안렌즈를 들여다보면서 조동 핸들로 대물렌즈를 스테이지로부터 멀어지게 하는 방향으로 움직여 초점을 맞춘다. 반대로 돌리면 프레파라트와 대물렌즈가 접촉하여 양쪽이 파손될 수 있으므로 주의한다.^[1]

9. 대략 초점이 맞으면 프레파라트를 움직여 관찰하기 쉬운 상을 찾는다. 상은 상하좌우가 반대로 비치므로 움직이는 방향에 주의한다.

10. 필요에 따라 레볼버를 회전시켜 고배율의 대물렌즈로 바꾼다. 일반적으로 동초점 설계가 되어 있어 대물렌즈를 바꿔도 초점이 어긋나지 않도록 되어 있지만, 다른 회사 제품 등 설계가 다른 렌즈가 섞여 있으면 잘 안 될 수도 있다.

11. 조리개로 조명을, 미동 핸들로 초점을 조절하면서 관찰한다.

12. 사용 후에는 먼지, 오염을 닦아내고 수납한다. 매우 빈번하게 사용하는 경우에는 반드시 렌즈를 뺄 필요는 없지만, 일반적으로는 장착할 때의 반대 순서로 빼내고 수납한다. 렌즈가 더러워졌다면 설명서에 따라 청소한다. 일반적으로는 카메라 렌즈와 마찬가지로 먼지를 털어내고 렌즈 클리닝 페이퍼로 닦는다. 피지 등의 오염에는 미량의 에탄올 등으로 적셔 사용한다.^[1]
조리개 사용법: 교육용 현미경에서는 원판 조리개를 갖는 경우가 많아, 스테이지의 뒷면에 크고 작은 구멍이 뚫린 원판이 부착되어 있다. 이것을 회전시켜 사용할 구멍을 선택하고, 조명되는 범위와 입사 광선의 각도 범위를 조절한다. 밝게 하려고 필요 이상으로 큰 구멍을 사용하여 관찰 영역 밖을 비추어도 미광이 증가하는 등 좋지 않다. 조리개는 상의 콘트라스트와 초점 심도(초점이 맞는 깊이)에도 관계하며, 작게 조일수록 둘 다 커진다. 다만 너무 작게 조이면 해상도가 떨어지고 어두워져 오히려 보기 어려워진다.^[1]
초점 조절: 손으로 얇게 자른 시료나 미생물을 물로 봉한 프레파라트에는 두께가 있어, 특히 고배율에서는 전체에 한 번에 초점을 맞출 수 없다. 따라서 항상 초점을 조절하면서 관찰할 필요가 있는데, 이럴 때는 크게 움직일 일은 없으므로 미동 핸들을 사용한다.^[1]
외부 광원 이용: 조명 장치로 반사경만 갖춘 경우, 자연광을 이용하면 실내에서는 특정 방향에서밖에 얻을 수 없으므로, 여러 명이 있을 경우 모두가 이용할 수 있는 것은 아니다. 날씨에도 영향을 받는다. 따라서 책상 위에 직관 형광등을 평평하게 놓는 광원 장치가 있어, 그 앞에 현미경을 나란히 놓고 이용한다. 또한, 거울 대신 그 고정부에 장착할 수 있는 간이 광원도 있다.^[1]

참조

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_[11] 문서 J. William Rosenthal, Spectacles and Other Vision Aids: A History and Guide to Collecting, Norman Publishing, 1996, page 391–2
_[12] 서적 The Origins of the Telescope https://books.google[...] Amsterdam University Press
_[13] 문서 Van Helden, p. 43
_[14] 문서 Shmaefsky, Brian (2006) Biotechnology 101. Greenwood. p. 171. ISBN0313335281.
_[15] 문서 Note: stories vary, including Zacharias Janssen had the help of his father Hans Martens (or sometimes said to have been built entirely by his father). Zacharias' probable birth date of 1585 (Van Helden, p. 28) makes it unlikely he invented it in 1590 and the claim of invention is based on the testimony of Zacharias Janssen's son, Johannes Zachariassen, who may have fabricated the whole story (Van Helden, p. 43).
_[16] 웹사이트 Who Invented the Microscope? http://www.livescien[...] 2013-09-14
_[17] 문서 Robert D. Huerta, Giants of Delft: Johannes Vermeer and the Natural Philosophers : the Parallel Search for Knowledge During the Age of Discovery, Bucknell University Press - 2003, page 126
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_[19] 문서 Daniel J. Boorstin, The Discoverers, Knopf Doubleday Publishing Group - 2011, page 327
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